Основные результаты

 
  • Разработан и протестирован ”биоинформационный конвейер” для картирования и анализа данных РНК-секвенирования на уровне единичных клеток (scRNA-seq ) и аннотации без эталонных геномов. Методы, подходы и протоколы были успешно опробованы на репрезентативных видах Demospongiae, Placozoa, четырех видах гребневиков, двух видах кишечнополостных, трех видах кольчатых червей и двух представителях моллюсков.
  • Выполнено секвенирование на уровне отдельных клеток у представителей Вryozoa, Phoronida, базальных вторичноротых, базальных хордовых, Lophotrochozoa и Ecdysozoa. Получено около 1,2 миллиона транскриптомов единичных клеток. Собрана информация по 16 типам животных, необходимая для объективной классификации нейронов и других типов клеток у Metazoa.
  • Протестированы различные подходы к подготовке проб для последующего геномного анализа единичных клеток на основе методов массивного параллельного scRNA-seq с использованием нескольких протоколов фиксации. Дана оценка потенциальных потерь молекулярной информации (20-30%), при использовании фиксированного материала.
  • Проведено тестирование и экспериментальная проверка новых протоколов для 3D-секвенирования генома с использованием морских беспозвоночных. Полученные данные о трехмерной организации геномoв у гребневиков и стрекающих позволили провести их сборку на хромосомном уровне.
  • Используя разработанные нами вычислительные подходы определено более 300 сигнальных/секреторных молекул и соответствующих генов, которые необходимы для идентификации гомологичных типов нейрональных клеток и наследственных линий у разных видов моллюсков, гребневиков и аннелид. Большинство сигнальных молекул оказались специфичными для отдельных классов и типов, что является дополнительным свидетельством широкого распространения параллельной эволюции в развитии гормональной и нейрональной сигнальных систем.
  • Разработаны и начали проверяться подходы для создания объективной классификации клеток/нейронов, а также идентификации новых типов клеток, используя информацию о 1,2 миллионе транскриптомов, полученных у представителей различных групп животных.
  • Проведено молекулярное картирование различных типов нейронов с использованием методов in situгибридизации на Porifera,Ctenophora, Gastropodaи Bryozoa. Такие исследования необходимы для проверки и дальнейшего анализа данных scRNA-seq. Результаты выявили беспрецедентную молекулярную гетерогенность нейронных популяций.
  • Проведено нейроанатомическое исследование нервных систем у гребневиков и выявлено более 80 морфологических типов клеток, включая около 10 нейрональных классов и рецепторов. Подтверждено наличие двух различных нервных систем в рамках одного организма.
  • Проведено микроанатомическое картирование типов клеток у представителей двух видов Placozoa, включая штамм Н4. Разработаны эффективные протоколы изоляции жизнеспособных единичных клеток для дальнейшего секвенирования, по которому секвенировано более 100 тыс. клеток.
  • Впервые выполнено метагеномное картирование микробиома у Branchiostomaи двух видов гребневиков. Это исследование позволило идентифицировать более 850 родов прокариотических организмов, включая представителей новых семейств морских бактерий.
  • Проведены экспедиции в районы Атлантического и Тихого океанов, включая глубоководные области. Выполнен сбор и молекулярная/геномная пробоподготовка для нескольких сотен видов, а также собраны уникальные коллекции морских беспозвоночных организмов.
  • Проведено секвенирование и первичная аннотация десяти новых геномов: 4 геномов у гребневиков, одного генома губок, Placozoa(H4), Xenoturbella, Dicyema, Cristatellaи Platynereis. Эти геномы используются для анализа и классификации отдельных клеток у наших модельных организмов и разработки теории эволюции нейронов и центральных нервных систем.

Основные виды работ и важнейшие результаты, полученные в 2017 году, суммированы ниже с акцентом на сравнительную транскриптомику единичных нейронов и исследование биоразнообразия:

  • Разработаны протоколы для проведения массового параллельного секвенирования транскриптомов единичных клеток, которые были адаптированы для представителей 12 типов животных.
  • В полевых условиях проведено тестирование высокоэффективной системы для массового параллельного разделения клеток с идентификацией и выделением тысяч единичных клеток для последующего геномного анализа. Создана крупномасштабная геномная библиотека единичных клеток из нервных систем животных, с возможными примерами конвергентной эволюции централизации нервных систем.
  • В общей сложности было секвенированo более 200 000 транскриптомов индивидуальных клеток из базовых таксонов Metazoa, включая гребневиков, двух видов губок, 2-х штаммов Trichoplax adhaerence (Placozoa), и двух представителей кишечнополостных – Nematostella и Спектр видов включает также представителей каждой из трех базовых линий биллатеральных животных: Lophotrochozoa/Spiralia (аннелиды на разных стадиях развития, мшанки (Cristalella), моллюски [Aplysia]); Ecdysozoa (насекомыe): Deuterostomia (Xenacoelomorpha [Xenoturbella, Acoela], полухордовых, хордовых (ланцетник) и др.). В целом, количество полученного материала превышает объемы, запланированные на все три года выполнения проекта. Сформирована одна из самых обширных в мире сравнительных геномных баз данных o единичных клетках животных, представляющих ключевые, с точки зрения возникновения инноваций в эволюции нервной системы, таксоны.
  • Впервые на уровне единичных клеток проведено секвенирование целого организма. Выполнено секвенирование практически всех клеточных типов у таких модельных видов как аннелиды (Platynereis), губки (Tethya) и Placozoa (Trichoplax). Получены неожиданные результаты для всех видов, и во всех случаях мы выявили от 50 до 100 типов клеток. Наши молекулярные подходы, в том числе анализ транскриптома единичных клеток (scRNA-seq), показали, что морфологически схожие клеточные / нейронные классы очень отличаются по молекулярному составу, и выявленное разнообразие клеточных типов значительно больше, чем предполагалось ранее.
  • Впервые выполнено полное секвенирование нервных систем на уровне единичных клеток у двух организмов (Aplysia и Drosophila). На настоящий момент, практически завершена независимая экспертная проверка идентификации клеточных типов (in situ гибридизация) и проведен первичный математический анализ классификации нейронов y этих двух модельных видов, которые являются ключевыми с точки зрения будущего геномного анализа единичных клеток v других нервных системах.
  • Секвенирование генома Aplysia, с использованием технологии 3-x мерного анализа геномной организации позволило существенно улучшить геномную сборку, для которой было достигнуто значение N50 более ~49Mb, а длина самого длинного scaffold > 172 Mb!!! Эти одна из лучших сборок генома беспозвоночных. К тому же, мы идентифицировали и охарактеризовали полный спектр мобильных элементов (транспозонные элементы (ТЕ) в геноме Aplysia, которые, как предполагается, могут участвовать в механизмах адаптации организмов к стрессу, и потенциально вносят свой вклад в процессы клеточной/нейрональной дифференциации. Более детально эти вопросы будут рассматриваться в следующем году.
  • На основе scRNA-seq четырнадцати видов мы выявили критерии для объективной классификации нервных клеток, используя данные секвенирования как целого мозга, так и всего организма. При этом мы начинаем создавать компьютерную инфраструктуру и формировать базы данных для сравнительной нейрогеномики и транскриптомики по выбранным модельным видам животных.
  • В процессе секвенирования сейчас находятся геномы мшанок и моллюсков, как важнейших моделей с точки зрения идентификации молекулярных механизмов процессов приводящих к централизации нервных систем у Bilateria.
  • Выполнен эволюционный анализ процессов приобретения/потери генов в эволюции Mollusca. В частности, проведено сравнение генома Aplysia и нескольких десятков видов моллюсков, представителей классов Аplacophora и Рolyplacophora с целью идентификации инноваций в эволюции нервной системы брюхоногих моллюсков по сравнению с базовыми таксонами этого типа животных.
  • Проведено четыре крупномасштабные экспедиции. В модельных регионах Тихого и Атлантического океанов выполнен сбор и каталогизация морских организмов, представителей более чем 20 типов животных. В общей сложности идентифицировано и генотипировано 1) ~ 1200 видов в заливе Канеохе (Гавайские острова, Тихий океан); 2) около 700 видов на островах Новой Каледонии (Южная часть Тихого океана); 3) ~ 400 видов в Северной части Южно-китайского моря (Тихий океан); 4) и более 1100 видов в районе острова Калверт (северо-восточная часть Тихого океана).
  • С целью интеграции исследований геномного разнообразия с программой идентификации родственных линий клеточных типов, начаты работы по сбору, идентификации и культивированию Сhoanoflagellata и Mycetozoa, сестринских групп Metazoa, важных с точки зрения понимания происхождения животных.
  • Организовано несколько обучающих семинаров, посвященных интеграции передовых исследований в области геномики, нейробиологии и изучения биоразнообразия.

Полученные результаты создали базу для первоначальной объективной идентификации и классификации разнообразия типов нейронов и других клеток у Metazoa, что является задачей будущих этапов проекта в 2018-2019 гг.

2018

Norekyan T., Moroz L. Neural System and Receptor Diversity in the CtenophoreBeroe abyssicola //Journal оf Comparative Neurology. – 2019, Accepted Author Manuscript. (WoS IF3.4) doi:10.1002/cne.24633

Chatterjee T., Dovgal I.,Pešić V. and Zawal A. A checklist of epibiont suctorian and peritrich ciliates (Ciliophora) on halacarid and hydrachnid mites (Acari: Halacaridae & Hydrachnidia) // Zootaxa. – 2018, 4457 (3). 415-430. (WoS IF 0.931)

Soldatov A.A.,Kukhareva T.A., Andreeva A.Y., Efremova E.S. Erythroid elements of hemolymph in Anadara kagoshimensis (Tokunaga, 1906) under condition of the combined action of hypoxia and hydrogen sulfide contamination // Russian Journal of Marine Biology. - 2018, Vol. 44, No. 6. – pp. 452 – 457 (WoS IF 0.409)

2017

N.V. Whelan, K. M. Kocot, T. P. Moroz, K. Mukherjee, P. Williams, G. Paulay, L.L. Moroz, K.M. Halanych Ctenophore relationships and their placement as the sister group to all other animals // Nature Ecology & Evolution. - VOL 1, NOVEMBER 2017. Р. 1737–1746.

Naumenko F., Abnizova I., Beka N., Orlov Y. Novel read density distribution score shows possible aligner artefacts, when mapping a single chromosome BMC Genomics V18, Suppl 11, 2017 (in press)

Солдатов А.А. Диффузионная способность гепатопаренхиматозного барьера скелетных мышц млекопитающих и морских рыб // Журнал эволюционной биохимиии и физиологии, 2018, т. 54, № 1

Nadolny A.A. Lost and found: Alopecosa krynickii  (Araneae: Lycosidae) in Crimea // Zootaxa. – 2017.